Confocal
공초점현미경은 confocal laser scanning microscope (CLSM)이라고 불리우며 해상력이 좋고 scanning 속도가 빠르기 때문에 오늘날 생물학분야의 연구에 가장 널리 이용되고 있다. 고속으로 회전하는 scanning mirror를 이용하여 laser beam을 specimen에 scanning하고 laser에 의해 발광된 형광 또는 반사광선(reflected primary beam)을 이용하여 영상을 관찰한다.
광원으로 사용되는 레이져는 argon ion laser(488 nm와 514 nm 파장을 가짐)와 krypton-argon ion laser(488, 568, 647 nm의 파장을 가짐)가 있으며 이들이 제공하는 파장의 범위 내에서 여러 종류의 형광을 이용함으로써 fluorescein, rhodamine 등의 형광이 부착된 세포내구조물을 관찰할 수 있다.
공초점현미경(confocal microscope)은 광학현미경기법과 전자현미경기법이 지니는 단점을 보완하는 동시에 이들이 갖지 못한 여러 가지 장점까지 보유하고 있는 현재까지 개발된 가장 우수한 현미경이라고 말할 수 있다. 기존의 광학현미경에 비해 초점심도가 낮기 때문에 (0.5 - 1.5 um) 초점을 벗어난 영상을 제거할 수 있어 선명하고 감도(sensitivity)높은 영상을 얻을 수있다.
응용방법으로는
세포소기관, 세포골격, RNA, DNA 또는 단백질 같은 거대분자의 세포 내 구조
조직 내에서 특정세포의 이동 관찰
입체영상(stereo image) 또는 삼차원영상(three-dimensional reconstruction)의 구성
세포 내 물질의 이동을 실시간으로 추적할 수 있는 4차원 영상의 관찰
세포 내 단백질 또는 이온의 정량적 변화나 반응현상
DAB 또는 silver grain 등과 같은 non-fluorescent label과 fluorescent label의 colocalization
IN Cell Analyzer 1000
Technological advances in fluorescence microscopy for HTS
Introduction
Fluorescence micro-imaging analysis는 주로 연구소에 국한된 시간이 많이 필요한 작업이었다. 최근 제약산업분야에서는 임상실험 테스트를 위한 화학물의 수가 대단히 많아지고 있다. 그래서, 이미지에 바탕을 둔 세포 분석은 더욱 효과적으로 치료약 발견과 개발을 촉진시킬 수 있는 새롭고 중요한 방법으로써 주목 받고 있다. 현재 대다수의 high-throughput image-based cellular screening(HTS) 분석은 report gene 발현과 ion flux과 같은 fluorescent probes reporting event의 전체적인 농도 변화를 알아낼 수 있다. 하지만, 많은 화합물들은 세포형태, 세포 소기관 형태, 세포 내 분자의 분포에서 미세하지만 의미 있는 변화를 유도한다. 고해상도 형광 현미경은 이런 변화들을 감지할 수 있는 기술이다.
형광 현미경 시스템은 세포 내부로 들어간 형광 probe로부터 방출되는 빛을 인식함으로써 유용한 정보를 가진 이미지를 만들어 낼 수 있다. 이미지의 품질은 공간과 시간적인 해상도에 의지하는 형광 세포분석방법에 있어서 대단히 중요하다. 다른 중요한 요소는 효율적인 이미지 분석 방식이다. 이런 방식을 이용하여 Image내에서 대조군과의 중요한 특징과 차이점을 식별하고, 형태, 위치 그리고 신호강도의 변화를 정량 할 수 있다. 신약개발과정 중에서 이미지에 바탕을 둔 세포 분석을 위하여 Amersciences는 IN Cell Analyzer 1000과 IN Cell Analyzer 3000 fluorescence micro imaging platforms을 개발하였다.
High Throughput Screening
IN Cell Analyzer 1000은 고해상도 CCD camera와 laser-based autofocus system을 가지고 있어서 연속적인 multicolor 이미지분석이 가능하다. CoolSNAP HQ CCD camera는 매우 sensitive하면서도 낮은 noise의 cell image를 만들어 낼 수 있도록 도와준다. 일반적인 2 color assay를 하기 위해서 96 well plate는 5분내에, 384 well plate는 15분에 처리할 수 있다. 그리고, IN Cell Analyzer 1000은 open system이기 때문에 자동 실험 장비의 장착이 가능하다. Read-chamber의 temperature control와 online liquid handling 등의 modular upgrade가 가능하다.
Applications for IN Cell Analyzer Systems
현재 사용되고 있는 granularity module은 receptor internalization (CypHer, Transfluor), nuclear condensation, mitochondrial trafficking, endosomal trafficking을, nuclear translocation module은 MAPKAP-k2, NFkB, SMAD2, STAT3, NFAT-c1, nuclear hormone receptors, STAT6을, object intensity module은 Calcium flux, G1ST, Cell viability, Membrane potential, HSV binding, Toxicity assays, Co-localization of probes을, neurite outgrowth module을 통하여 각종 therapeutic area를 detection할 수 있다. 앞서 설명한 4가지의 modules로 detection이 가능한 분야는 Inflammation, neuronal growth and differentiation, pain, CNS disorders, colon and breast cancer, cardiac hypertrophy, rheumatoid arthritis, cardiac disease, Alzheimer’s disease, immuno-suppressants and anti-inflammatory drugs등에 이용될 수 있다. |
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